本報(bào)記者 張佳星

　　諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)已然揭曉，但生物學(xué)家們還有機(jī)會(huì)。

　　據(jù)統(tǒng)計(jì)，1990年以來(lái)，有16次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了生物學(xué)方面的成就。以2017和2018年為例，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)就分別頒給了發(fā)明冷凍電鏡和對(duì)活性蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化研究。

　　被稱為諾貝爾風(fēng)向標(biāo)的引文桂冠獎(jiǎng)，今年其化學(xué)獎(jiǎng)也有兩項(xiàng)與生命科學(xué)密切相關(guān)，當(dāng)看到Southern(直譯“南方”)的鼎鼎大名時(shí)，記者當(dāng)即決定“押寶”這個(gè)無(wú)處不在的DNA驗(yàn)證技術(shù)。

　　Southern印跡法由埃德溫·薩瑟恩(Edwin Southern)在英國(guó)醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)從事科學(xué)研究時(shí)發(fā)明，相關(guān)論文首次發(fā)表時(shí)他僅僅35歲，以他名字命名的DNA印跡技術(shù)，可用于確定特定DNA序列，并判斷其功能、是否變異、圖譜位置等，他后續(xù)還發(fā)明了DNA芯片等技術(shù)。引文桂冠獎(jiǎng)稱他的發(fā)明是高通量核酸分析工作及基因圖譜、診斷和篩查的開端，也是當(dāng)今個(gè)性化醫(yī)療的基礎(chǔ)。

　　可檢測(cè)遺傳病中的單基因突變

　　2007年江蘇省高考生物學(xué)試卷中有一道關(guān)于Southern印跡法的試題，題目給出Southern印跡試驗(yàn)后獲得的圖像，請(qǐng)學(xué)生判斷不同的條帶說(shuō)明了什么生命科學(xué)意義——

　　單基因遺傳病可以通過(guò)核酸雜交技術(shù)(Southern印跡法)進(jìn)行早期診斷。鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種在地中海地區(qū)發(fā)病率較高的單基因遺傳病。已知紅細(xì)胞正常個(gè)體的基因型為BB，鐮刀型細(xì)胞貧血癥患者的基因型為Bb。有一對(duì)夫婦被檢測(cè)出均為該致病基因的攜帶者，為了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都進(jìn)行產(chǎn)前診斷。題目給出產(chǎn)前核酸分子雜交診斷和結(jié)果示意圖。根據(jù)凝膠電泳帶譜分析可以確定胎兒是否患有鐮刀型細(xì)胞貧血癥。

　　其中提到的B和b體現(xiàn)在DNA上僅僅是一個(gè)堿基的區(qū)別，如何能夠?qū)⑵鋮^(qū)分開來(lái)呢？Southern印跡法做到了。

　　它的原理可以形象理解為“釣魚執(zhí)法”和“打出原形”兩步——

　　B和b由于一個(gè)堿基的不同在不同的酶切反應(yīng)中就會(huì)反應(yīng)不同，通過(guò)特定酶的“釣魚執(zhí)法”，兩種基因“你向左，我向右”，但在外表還看不出來(lái)，這時(shí)候“鎖住原形”(轉(zhuǎn)移到尼龍膜等能鎖住DNA的膜上)通過(guò)可顯影的放射性同位素等做標(biāo)記，讓探針DNA把鎖住的原形呈現(xiàn)出來(lái)，實(shí)現(xiàn)“可視化”。由此，通過(guò)Southern印跡法，些微的DNA突變可以被檢測(cè)出來(lái)。

　　題目中提及的鐮刀型細(xì)胞貧血癥的基因基礎(chǔ)，正是薩瑟恩1978年利用該方法發(fā)現(xiàn)的。與此同時(shí)，薩瑟恩決定使用分子生物學(xué)方法對(duì)人類基因組進(jìn)行作圖。為了這個(gè)計(jì)劃中大規(guī)模序列分析的需要，薩瑟恩進(jìn)行了多項(xiàng)技術(shù)革新，包括使用凝膠電泳對(duì)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的片段精確分子量的確定、根據(jù)凝膠結(jié)果對(duì)DNA序列進(jìn)行自動(dòng)讀取等。

　　衍生出對(duì)蛋白等生命分子的檢測(cè)方法

　　由于以薩瑟恩名字命名的Southern印跡法與“南方的”英文一樣，隨后誕生的其他印跡法分別以Northern、Western命名。

　　當(dāng)待分析的物質(zhì)由DNA轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA時(shí)，“南”變成了“北”。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所蔡仕英等在介紹《電泳的原理、應(yīng)用及進(jìn)展》中提道：在電流作用下，薩瑟恩成功地將DNA片段從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上進(jìn)行分子雜交分析，因此稱為Southern印跡法。后來(lái)，艾爾文(Alwine)用類似方法也成功地將RNA從電泳膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上作分子雜交分析，但他并沒有稱這一技術(shù)為Alwine印跡法，而是稱之為Northern印跡法，以便與Southern印跡法相對(duì)應(yīng)。

　　1981年布瑞特(Burette)又成功地將SDS-PAGE膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上進(jìn)行免疫學(xué)分析(如抗原抗體結(jié)合、蛋白質(zhì)與配基結(jié)合等)，繼Alwine之后，Burette稱這一技術(shù)為Western印跡法。蛋白印跡法是一項(xiàng)廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞或組織提取物中蛋白表達(dá)水平的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)借助抗體與目的蛋白的結(jié)合作用，測(cè)量生物樣品中的蛋白質(zhì)水平。

　　這樣一來(lái)，在印跡電泳這個(gè)家族中，僅缺一個(gè)Eastern印跡法。后來(lái)有人提議將IEF膠(即等電聚焦電泳)中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上的技術(shù)稱為Eastern印跡法，但這一建議并未被廣泛接受。Eastern印跡法是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的技術(shù)，其檢測(cè)目標(biāo)是蛋白質(zhì)上特定的修飾基團(tuán)或部位，如脂肪酸鏈、糖基、磷酸化的氨基酸等等。在Eastern印跡法的實(shí)驗(yàn)中，通常要先用2D電泳將蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)到膜上，再用特異的探針去檢測(cè)。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能過(guò)程中普遍存在的調(diào)控手段。

　　在印跡電泳技術(shù)中，薩瑟恩作為開創(chuàng)者、先行者發(fā)明的技術(shù)，衍生出人們對(duì)于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生命活動(dòng)的基本分子物質(zhì)的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法，引領(lǐng)了“‘南’者為大、號(hào)令四方”的研究探索次序和格局。

　　不僅如此，人們還舉一反三，實(shí)現(xiàn)了菌落上的定位檢測(cè)。用類似的方法將生長(zhǎng)在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落做成復(fù)制皿后再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維紙上變性并與特定的放射標(biāo)記的探針雜交，可以篩選出帶有特定DNA片段的菌落，這種技術(shù)稱為菌落雜交，又稱原位雜交。

　　菌落雜交，是因?yàn)樯�長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來(lái)的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。這種方法對(duì)于從成千上萬(wàn)的菌落或噬菌斑中鑒定出含有重組體分子的菌落或噬菌斑具有特殊的實(shí)用價(jià)值。

　　DNA芯片使基因測(cè)序效率提升千萬(wàn)倍

　　諾貝爾獎(jiǎng)的授予是為了表彰對(duì)人類做出最重大貢獻(xiàn)的人，迄今為止，Southern雜交技術(shù)依舊活躍在生命科學(xué)研究的最前沿，并逐步走出實(shí)驗(yàn)室走進(jìn)臨床，用于疾病的診斷和檢測(cè)。

　　最新的研究論文顯示，科研人員利用Southern雜交技術(shù)對(duì)人類的線粒體DNA進(jìn)行定量。在單個(gè)細(xì)胞中線粒體DNA基因組是整體基因組的“滄海一粟”，這使得定量檢測(cè)十分困難。

　　量少卻至關(guān)重要，線粒體DNA的缺失或突變往往是致命的，例如，在某些核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑治療的人類免疫缺陷病毒感染患者中，線粒體毒性和線粒體DNA缺失也已報(bào)道。因此，用進(jìn)一步發(fā)展的Southern印跡法來(lái)估計(jì)人類基因組DNA樣品中的線粒體DNA含量十分重要。迄今為止，Southern雜交技術(shù)仍舊是兼顧穩(wěn)、準(zhǔn)、快的不可替代的DNA檢測(cè)技術(shù)�！癝outhern雜交技術(shù)已成為檢測(cè)特定DNA片段的經(jīng)典方法之一。此法快速、準(zhǔn)確、靈敏，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物鑒定、動(dòng)物疾病診斷以及DNA指紋分析等方面的研究。”新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授馬正海等在相關(guān)技術(shù)的改進(jìn)方面做了探索總結(jié)的工作，使得該技術(shù)的實(shí)現(xiàn)更加便利。

　　Southern印跡法的常青不衰還體現(xiàn)在薩瑟恩本人不間斷的科研生涯中。資料顯示，在發(fā)明了著名的Southern印跡雜交之后，他從英國(guó)醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)(MRC)來(lái)到牛津大學(xué)，在特殊的玻璃表面通過(guò)有效的組合化學(xué)方法合成了特定寡核苷酸序列，該方法最終發(fā)展成為DNA芯片。1996年，薩瑟恩建立了牛津基因技術(shù)公司(OGT)，主要進(jìn)行高通量的核酸分析工作。

　　DNA芯片技術(shù)已經(jīng)稱為現(xiàn)代生命科學(xué)儀器設(shè)備繞不開的必備組件，使得檢測(cè)效率實(shí)現(xiàn)了千萬(wàn)倍的提升，也使得基因測(cè)序、精準(zhǔn)醫(yī)療的成本大大降低，有望普惠大眾。